61 DESAFIOS DA HIGIENIZAÇÃO NA INDÚSTRIA ALIMENTAR os tratamentos por campos elétricos pulsados e luz pulsada, o dióxido de carbono a alta pressão, os tratamentos por plasma, entre outros). FATORES QUE PODEM INDUZIR A REATIVAÇÃO DE PATÓGENOS VBNC A reativação de bactérias VBNC, também designada por “ressurreição”, refere-se ao processo pelo qual estas bactérias, que perderam a capacidade de crescer em meios de cultura convencionais, recuperam a sua atividade metabólica e a capacidade de se multiplicar, regressando a um estado cultivável e, consequentemente, patogénico. Importa salientar que, em muitas situações, as condições ideais para a reativação ao estado patogénico ocorrem no interior do organismo, podendo dar origem a intoxicações alimentares graves. Os principais fatores suscetíveis de reativar bactérias VBNC incluem: • Aumento da concentração de nutrientes: a adição de um meio de cultura rico foi um dos primeiros métodos utilizados para a ressuscitação de bactérias VBNC. • Alterações de temperatura: tanto o aumento como a diminuição da temperatura podem desencadear a reativação, especialmente em bactérias induzidas ao estado VBNC por temperaturas extremas. • Estímulos químicos: determinados compostos químicos podem promover a reativação, como o piruvato de sódio ou a adição de aminoácidos. • Estímulos biológicos: verificou-se que a cocultura com outras espécies bacterianas, ou mesmo com algumas leveduras, pode induzir a reativação em determinadas espécies. Além disso, proteínas como as Rpf (Resuscitation Promoting Factor) ou determinadas moléculas de sinalização de quorum sensing desempenham um papel crucial neste processo. METODOLOGIAS PARA A DETEÇÃO DE BACTÉRIAS EM ESTADO VBNC Uma vez que, no estado VBNC, as bactérias perdem a capacidade de proliferar, não podem ser detetadas pelos métodos tradicionais de cultura, que são os atualmente estabelecidos pela legislação europeia. Em alternativa, os seguintes métodos podem revelar-se particularmente úteis para a deteção de bactérias viáveis, independentemente de serem ou não cultiváveis: • Métodos baseados em biologia molecular: baseiam-se sobretudo na técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), com adaptações específicas para a deteção de células viáveis. Por exemplo, a técnica PMA-qPCR utiliza moléculas que se ligam ao ADN de bactérias mortas e impedem a sua amplificação por PCR, permitindo que apenas as bactérias vivas presentes na amostra sejam detetadas. • Citometria de fluxo: permite o estudo e a classificação de células individuais em suspensão através da utilização de um laser e de detetores óticos, possibilitando a distinção entre células vivas e não viáveis mediante a utilização de corantes fluorescentes específicos. • Tecnologias ómicas: permitem avaliar a viabilidade celular através da análise da atividade biológica, como a expressão génica e as vias metabólicas ativas. Entre as suas principais vantagens destacam-se a elevada sensibilidade, a capacidade de detetar múltiplas espécies em simultâneo e a obtenção de informação global sobre o metabolismo e a expressão génica. PROJETO VBNC-PATHOGENS No âmbito do projeto VBNCPATHOGENS, a Ainia pretende identificar os processos produtivos da indústria alimentar que podem induzir o estado VBNC e a sua posterior reativação para o estado patogénico. Paralelamente, trabalha no desenvolvimento de soluções tecnológicas para a deteção de bactérias VBNC transmitidas ao longo da cadeia alimentar, com particular enfoque em Salmonella spp. e Listeria monocytogenes. O objetivo da Ainia é disponibilizar às empresas da Comunidade Valenciana ferramentas que permitam avaliar o risco e a incidência destas bactérias nos seus produtos e processos, bem como verificar a eficácia dos métodos e produtos de limpeza e desinfeção utilizados. Para esse efeito, o projeto conta com a colaboração de três empresas do setor alimentar e de uma empresa especializada em higiene industrial. Este projeto é um projeto de I+D+i de carácter não económico, integrado no programa de I+D de um Centro Tecnológico da Comunidade Valenciana, desenvolvido em colaboração com empresas e financiado pelo IVACE+i. n
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